Na biologia celular avançada e na reprodução assistida, a visualização de espécimes vivos e transparentes — amostras com baixo índice de refração — representou, durante décadas, um dos maiores gargalos da microscopia. O Contraste de Interferência Diferencial (DIC), baseado na ótica de Nomarski, consolidou-se como o padrão-ouro em sistemas manuais. Contudo, a Biosystems, com o seu legado de excelência no mercado de instrumentação desde 1990, identifica que a necessidade de alta produtividade e dados estatísticos robustos exige uma transição para a análise quantitativa automatizada através do High Contrast Brightfield (HCBF).
As Limitações Intrínsecas do DIC na Automação
O DIC é uma técnica interferométrica que depende da polarização da luz e da introdução de prismas de Wollaston no caminho ótico para criar um gradiente de fase que o olho humano interpreta como relevo. Embora produza imagens esteticamente ricas, a sua implementação em sistemas automatizados de microplacas é tecnicamente frágil.
A dependência de ajustes manuais precisos para cada amostra e a sensibilidade extrema a variações na espessura do plástico das placas de cultura inviabilizam o modo walk-away. Além disso, o DIC é altamente suscetível ao menisco do líquido no poço, o que gera sombras assimétricas que impedem uma segmentação digital precisa. Em ensaios que exigem rastreabilidade e reprodutibilidade metrológica, o DIC manual introduz uma variável de erro subjetiva que o pesquisador moderno não pode mais aceitar.
High Contrast Brightfield: A Ciência do Defocused Imaging
Para superar as lacunas do DIC, a tecnologia Agilent BioTek implementa o High Contrast Brightfield (HCBF). Diferente da interferometria de fase, o HCBF utiliza o princípio físico da difração controlada e do defocused imaging. Através do software Gen5, o sistema captura a imagem num plano focal ligeiramente deslocado — o chamado Z-Offset.
Quando a luz atravessa uma célula transparente, ocorre um ligeiro desvio de fase. Ao desfocar a imagem de forma controlada (como o valor otimizado de -220 µm para certas linhagens celulares), a luz difratada converge para criar um ponto brilhante central (halo) e contornos nítidos. Este fenômeno transforma uma célula virtualmente invisível num objeto discreto com alto contraste, permitindo que os algoritmos de segmentação realizem a contagem label-free com uma precisão superior a 98% em relação aos métodos fluorescentes.
Configuração e Análise de HCBF no Gen5
Acompanhe neste vídeo técnico os passos para configurar a aquisição e análise label-free, eliminando a necessidade de corantes citotóxicos.
Dual Configuration: Versatilidade Ótica sem Intervenção Manual
Um dos diferenciais críticos da plataforma Cytation 7 distribuída pela Biosystems é a capacidade de operar em configuração dual. O sistema permite alternar automaticamente entre o Standard Brightfield (ideal para tecidos espessos e esferoides) e o High Contrast Brightfield (otimizado para monocamadas e motilidade celular). Esta transição ocorre via software, garantindo que o plano de foco e a integridade da amostra sejam preservados, especialmente em ensaios que utilizam injeção angular de 21° para proteger amostras em suspensão.
Documentação Técnica e Fundamentação Física
Acesse os Technical Overviews originais da Agilent para uma compreensão profunda sobre a ótica dual e contagem de células sem marcação.
GUIA TÉCNICO HCBF (PDF) ÓTICA DUAL BF/HCBF (PDF)Conclusão: Do Estético ao Quantitativo
Enquanto o DIC oferece uma visualização qualitativa impressionante para o olho humano, o HCBF entrega a robustez numérica necessária para a ciência de dados moderna. Ao remover a subjetividade do ajuste de foco e das sombras interferométricas, a Biosystems capacita os pesquisadores a obterem imagens publicáveis e dados inquestionáveis, blindando as suas investigações contra falhas de reprodutibilidade.
Evolua a sua Microscopia
Fale com os nossos especialistas técnicos e descubra como migrar os seus protocolos DIC para a alta performance do High Contrast Brightfield.
VER MODELO CYTATION 7TIRAR DÚVIDAS NO WHATSAPP SOLICITAR COTAÇÃO